DURANTE EL SEMESTRE  SE LLEVARON A CABO PRUEBAS MICROBIOLOGICAS APLICANDO LA TECNICA QUE PREVIAMENTE NOS INDICO NUESTRA MAESTRA.

SELEAGRADECE ALA PROFESORA : MARIA DE LOURDES RIVERA HERNANDEZ POR EL APOYO QUE NOS BRINDO DURANTE ESTE PERIODO YA QUE GRACIAS A LOS CONOCIMIENTOS QUE NOS BRINDO HEMOS LOGRADO CONCLUIR DE MANERA ADECUADA.

EN CONCLUSION  HE LOGRADO CONOCER ACERCA DE LAMICROBIOLOGIA AUNQUE FALTA MUCHO MAS POR CONOCER YA QUE SU ESTUDIO ES MUY AMPLIO PERO SIN DUDA APRENDI A REALIZAR UNA SIEMBRA  MICROBIOLOGICA, LOS CONOCIMIENTOS DE CADA AGAR UTILIZADO EN LAS PRACTICAS,LA REALIZACION DE ANTIBIOGRAMA Y LAS PRUEBAS QUE SEREALIZAN COMO LACOAGULASA Y CATALAZA.

REDACTADO POR:

Rosa Isela Sánchez Vidal

Catalasa

Fundamento Pone de manifiesto la presencia del enzima catalasa en una bacteria. Esta enzima es capaz de descomponer el peróxido de hidrógeno (agua oxigenada) en agua y oxígeno, con la consiguiente aparición de burbujas.     Realización práctica   Utilizar una placa con el microorganismos crecido y en una zona donde haya bastante crecimiento añadir unas gotas de agua oxigenada y observar si en el transcurso de unos segundos se produce o no la aparición de burbujas

 

 

Catalasa positivo: se produce la aparición de burbujas que corresponde a la liberación de oxígeno, lo que indica que  la bacteria tiene el enzima catalasa.  
Catalasa negativo:  no se producen burbujas por tanto la bacteria no posee dicho enzima.

 

 

Prueba de Coagulasa para Staphylococcus

 

 

Permite diferenciar Staphylococcus aureus (coagulasa positivo) del resto de especies de Staphylococcus (coagulasas negativos). La técnica en tubo detecta coagulasa libre y ligada.
Mecanismo de acción de la coagulasa libre: procoagulasa (enzima extracelular bacteriana) reacciona con un factor activador presente en el plasma sanguíneo similar a la protrombina, dando lugar a un complejo análogo a la trombina (coagulasa propiamente dicha) que reacciona con fibrinógeno formando un coágulo de fibrina en ausencia de Ca2+.
La coagulasa ligada o factor de agregación actúa directamente sobre el fibrinógeno y lo convierte en fibrina. No requiere la presencia de activadores plasmáticos.

 

Diferentes métodos de siembra

- Sembrar: Es el acto de colocar el material bacteriológico en el medio de cultivo para promover su crecimiento y desarrollo, y subsiguiente multiplicación.

El resultado de una siembra se llama: Cultivo

 

·         Las siembras pueden ser:

- Primarias: cuando el material es inoculado en los medios por primera vez

- Secundarias: cuando el material a inocular procede de una siembra primaria

 

Métodos Generales:

1) Siembra por dilución: Se toma el tubo de ensayo con medio líquido, como el caldo simple. Se toma el material a diluir y se siembra en el  tubo con el uso del asa cargada con el  material bacteriológico, se agita, con movimientos moderados.

Medio de cultivo: Liquido

Instrumento: Asa

Finalidad: poner la bacteria en suspensión

2) Siembra por estrías en superficie: Se siembra el material  en la superficie de el agar inclinado en un tubo de ensayo,  allí se extiende por toda la superficie con el asa bacteriológica, previamente esterilizada y cargada con el material a sembrar, haciendo estrías no muy amplias, pero tampoco muy estrechas. Se inicia por la parte más profunda de la superficie inclinada  y se termina la estría en la parte más cerca de la boca del tubo.

Medio de cultivo: agar base inclinado

Instrumento: asa o aguja bacteriológica

 

 

3) Siembra por estría por agotamiento: Con éste procedimiento se puede conseguir  una buena separación de las colonias y aislarlas fácilmente. Para ello se funde el medio de cultivo, se vuelca en caja de Petri y se deja solidificar. Con el asa previamente esterilizada se toma material de un cultivo heterogéneo y se descarga sobre la superficie del medio formando estrías. Esto puede realizarse de varias formas:

a- Al comienzo se coloca el inoculo, luego se continúa con las estrías. Cuando se quiere obtener colonias muy separadas se puede utilizar dos o tres placas de Petri, para lo cual se repite la operación sin tomar con el asa nuevo material.

b- Se puede dividir la placa de Petri en cuatro cuadrantes; una vez depositado el material en el primero, siguiendo el sentido de las agujas del reloj, se hace una estría luego en el segundo, tercero y cuarto cuadrante sin cargar nuevamente el asa; en el último cuadrante aparecerán las colonias aisladas

c- El inóculo se extiende sobre una pequeña zona de la placa, próxima al borde, se esteriliza el asa y se traza otra estría a partir del depósito y así sucesivamente.

Medio de cultivo: solido en placa de Petri

Instrumento. Asa

Finalidad. Obtener colonias aisladas

 

 4) Por picadura o punción: Con una aguja se toma el material que se quiere sembrar y se lo introduce en el tubo, con medio semisólido. Introducir la aguja hasta el fondo, formando un canal de punción, trayecto por el cual la retiraremos luego. Este método se utiliza para estudiar la movilidad de las bacterias. 

Medio de cultivo. Semisólido

Instrumento: aguja bacteriológica

Finalidad: Estudiar la movilidad de las bacterias

5) Siembra en TSI: (Por picadura y estrías en superficie): el TSI (Triple Sugar Iron) es un medio que contiene glucosa, sacarosa y lactosa, hierro y un indicador que es el rojo fenol.

En este medio sembraremos por picadura y estrías en superficie, como ya conocemos, para estudiar los cambios que ocurrirán en superficie y profundidad. A lo largo del canal se desarrollan los microorganismos, y según lo hagan en la parte superior o inferior del tubo, estarán indicando su comportamiento frente a los azucares, los cambios indican lo siguiente:

 

 

 

Siembra masiva. Tome un hisopo estéril e introdúzcalo en el tubo que contiene la muestra a sembrar, luego frote toda la superficie del agar. Le evaluación del crecimiento en las placas de agar se hace a través de la observación de colonias en la superficie.

 

Siembra en agar inclinado. Esta se realiza por punción y por estría. Por punción: Introduzca el inoculo con el asa recta hasta el fondo del medio con un solo movimiento y teniendo cuidado de hacer el mismo trayecto de entrada que de salida. Por estría: Extienda el inoculo sobre el agar inclinado deslizando suavemente el asa por la superficie en forma de zigzag.

 

No olvide flamear la boca del tubo antes y después de la siembra. Evalué la presencia de crecimiento en el agar por la formación de una película o por el crecimiento de colonias en la superficie.

 

Siembra en profundidad. Marque la caja de petri estéril con el número de grupo, la fecha y siembra en profundidad. Abra ligeramente la caja de Petri cerca del mechero.

º Abra un tubo con cultivo de bacterias y con ayuda de una pipeta de Pasteur plástica, transfiera 1 ml de éste cultivo a la base de la caja de petri estéril. Descarte la pipeta en el frasco de boca ancha con clorox.

 

º Vierta un poco de agar nutritivo en la caja de Petri, tape la caja y luego realice movimientos suaves sobre el mesón, en el sentido de las agujas del reloj, luego al contrario, en forma de L y L invertida, y por último en forma de 8. Esto garantiza una distribución homogénea de las bacterias en todo el agar para facilitar su posterior recuento.

 

º Envuelva las cajas de Petri y los tubos con cinta de enmascarar, márquelos con el número de grupo, la fecha. Luego incube 37º c por 48 horas.

Entregue al coordinador del laboratorio los cultivos bacterianos usados

 

Siembra de medio líquido a sólido. Se procede en la misma forma que en la siembra anterior pero con el asa de argolla. Si la siembra es en tubo recuerde hacer punción y estría. Si es en caja de Petri puede utilizar diferentes sistemas como estría, agotamiento, rejilla con el fin de lograr un cultivo puro.

 

Siembra de medio sólido a sólido. Se realiza de la misma forma que en la siembra anterior pero utilizando el asa recta. Los medios sólidos contienen agar en proporción de 1.5 a 2.0% y se emplean para obtener colonias aisladas. Las placas de agar se pueden inocular mediante varios métodos: como estrías, agotamiento y rejilla con el fin de lograr un cultivo puro.

 

Siembra en rejilla. Realice una estría que atraviese el centro del agar. Luego realice estrías en ángulo recto con respecto a la estría inicial. Voltee el agar en ángulo de 90 grados y realice estría hasta cubrir todo el agar.

 

Siembra por agotamiento. Tome una placa de agar, marque la base de la caja de petri con los números 1, 2 y 3. Coloque la muestra a sembrar en el numero 1, realice estrías hasta la mitad de la caja. Esterilice el asa y gire la caja hasta el numero 2, tome las dos ultimas estrías y siga estriando hasta el numero 3. Gire la caja y termine de estriar, tenga cuidado de no tocar las estrías ya hechas.

 

 

Siembra de medio sólido a medio líquido

Marque correctamente los tubos con el número del grupo, sistema de siembra utilizado y la fecha. Para crear un ambiente de esterilidad encienda el mechero y trabaje siempre al lado de el. Esterilice un asa recta a la llama de un mechero y déjela enfriar

 

Tome el tubo que contiene la muestra a sembrar, retire la tapa del tubo, flamee la boca del tubo. Introduzca el asa en tubo sin tocar las paredes y tome un poco de colonia del cultivo, flamee nuevamente la boca del tubo, tapelo y dejelo en una gradilla. Tome el tubo de caldo nutritivo estéril en el cual va a colocar la muestra, destapelo, flameando la boca el tubo con el mechero e introduzca el asa con la muestra obtenida. Realice movimientos de rotación con el asa para emulsionar con el caldo las paredes del tubo.

 

Retire el asa, flamee la boca del tubo y tape. Esterilice el asa en el mechero después de usarla. Incube los tubos a 37ºC por 24 horas. Observar el crecimiento obtenido. Si no hay crecimiento el caldo queda transparente.

 

 

Sistemas de Siembra:

Antes de iniciar la siembra se deben cumplir determinadas condiciones:

 

• Esterilización de los instrumentos de trabajo y de los medios de cultivo. Los medios de cultivo se esterilizan con calor húmedo en la autoclave y los materiales de vidrio se esterilizan con calor seco en el horno Pasteur. En el caso de objetos metálicos, como el asa de siembra, que se esterilizan en el momento de su utilización, se mantienen en la llama hasta que se pongan al rojo, teniendo la precaución de enfriarlos antes de su uso.

 

• Que el inóculo no se contamine, modifique o destruya para lo cual se utiliza calor directo, flameando las bocas de los tubos de ensayo, matraces, la pipeta y demás elementos antes y después de su utilización.

 

• Esterilización del área de trabajo para evitar contaminaciones durante el manejo del instrumental y de los medios de cultivo. Se utilizan la cámara de flujo laminar. Si no se dispone de ella, se utiliza un mechero Bunsen que, debido a que fuerza la circulación del aire en sentido vertical y hacia arriba, es capaz de crear un ambiente semiésteril en la zona inmediata alrededor y debajo de la llama, de forma que los riesgos de contaminación disminuyen considerablemente.

 

¿Cómo se realiza el cultivo?

Sembrar es colocar una muestra de inóculo, en un medio de cultivo para obtener el crecimiento de los microorganismos. Para ello se extiende la muestra sobre caja de Petri, que contiene un gel (Agar) al que se han añadido las substancias que necesitan los microorganismos para crecer. A esto lo llamamos medio de cultivo. A veces se añaden otras clases de sustancias; por ejemplo, para impedir el crecimiento de otras bacterias que podrían contaminar el cultivo. La siembra se puede hacer en otros tipos de medios de cultivo, como tubos de vidrio con gel, frascos con líquidos nutritivos para los microorganismos.

 

A continuación se procede a la "incubación" del medio ya sembrado. En cada caso se hace en condiciones particulares de presión de oxígeno, temperatura, agitación, duración, etc. Muchas de las bacterias patógenas crecen bien a temperaturas cercanas a los 37ºC habituales de nuestro organismo.

 

Si el cultivo bacteriano tiene éxito, crecerán "colonias" de bacterias en el medio de cultivo. Estas colonias tienen características de color, forma, tamaño etc. propias de cada bacteria y esto nos ayuda a identificarlas. También se puede someter a las bacterias de las colonias a pruebas bioquímicas o de otro tipo para lograr su identificación. Algunas bacterias son muy difíciles de cultivar, otras tardan mucho tiempo en crecer y algunas, finalmente, no se han conseguido cultivar.

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

El antibiograma es la prueba microbiológica que se realiza para determinar la sensibilidad de una colonia bacteriana a un antibiótico o grupo de antibióticos.

 

En el ámbito clínico, el estudio sobre la bacteria causante de la infección y sobre el antibiograma es entregado al médico responsable del paciente. Este último es quien se encarga de decidir el tipo de antibiótico adecuado, dependiendo de los resultados del antibiograma y de otros factores procedentes del paciente, como por ejemplo una alergia a la penicilina.

Utilidad: La razón por la cual es conveniente el estudio del antibiograma de una bacteria determinada radica en el hecho de la diferente sensibilidad a los antibióticos de las distintas especies bacterianas y, más aún, en el hecho de que en numerosas especies existen grandes diferencias de sensibilidad a un determinado antibiótico entre unas y otras cepas.
El antibiograma es un método de diagnóstico rápido y preciso
Con ayuda del antibiograma se puede escoger el antibiótico más adecuado para el tratamiento de una enfermedad.

Los objetivos son:

Determinar la sensibilidad a diversos antibióticos de un determinado microorganismo

Ø  Comprender el concepto de antibiótico y su especificidad de acción sobre determinadas bacterias.

Ø  Conocer el concepto de cepa sensible y resistente.

Ø  Entender el concepto de halo de inhibición.

Ø  Ser consciente de la importancia de la higiene y el cuidado en la manipulación de materiales biológicos.

Ø  Comprender la importancia de la eliminación de los residuos orgánicos

Ø  Conocer el instrumental de laboratorio necesario en microbiología y los procedimientos para su utilización.

 

Lectura del antibiograma.

 Una vez sembrada una placa de un medio de cultivo adecuado y colocados los distintos discos impregnados de antibiótico y una vez colocada a incubación en la estufa durante unas horas, se procede a la lectura de los resultados, que puede hacerse a intervalos periódicos, basada en la medición del halo de inhibición. Según la amplitud de este halo los gérmenes se clasifican en:

-RESISTENTES
-SENSIBLES
-MUY SENSIBLES

Debe tenerse presente que el diámetro del halo de inhibición depende también de la difusibilidad del antibiótico y, por tanto, no es una medida absoluta de la eficacia.

Los datos que proporciona el antibiograma son muy valiosos pero su aplicación no es tan sencilla. Para la prescripción correcta de los antibióticos hay que tener en cuenta siempre la naturaleza del proceso infeccioso, la historia clínica del paciente, el mecanismo de acción del antibiótico, la toxicidad, las posibles sensibilizaciones del paciente, la vía de administración, etc.

 

CONCLUSION

Analizamos este laboratorio llevándonos una enseñanza productiva para lo que nos compete con nuestra carrera, aprendiendo los conceptos de antibióticos y su especificidad de acción sobre diferentes bacterias siendo así unos de los puntos más importantes en los antibiogramas, saber un poco más de la sensibilidad de los diversos antibióticos en determinados microorganismos, una parte importante que nos deja de enseñanza este laboratorio es la práctica de higiene diaria que debemos tener todas persona para disminuir los casos de bacterias que podemos contraer.